Количественный анализ нуклеиновых кислот
Количественный анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации
Спектрофотометрический анализ
Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают
При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл)−1 см−1, для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл)−1 см−1 и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл)−1 см−1). Отсюда, оптическая плотность (англ. OD, optical density) равная 1 соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяет при концентрациях до 2 OD.[1] Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего соседства.[2]
Коэффициенты пересчета
| Тип нуклеиновой кислоты | Концентрация (мкг/мл) для 1 единицы A260 |
|---|---|
| dsDNA (двуцепочечная ДНК) | 50 |
| ssDNA (одноцепочечная ДНК) | 37 |
| ssRNA (одноцепочечная РНК) | 40 |
Кюветы для анализа
Для определения концентрации образца найденную в стандартной кювете с величиной оптического пути 10 мм оптическую плотность необходимо разделить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.
Кюветы малого объема
Для многих биологических исследований (
Чистота образца
Часто образцы нуклеиновых кислот содержат примеси белков и других органических веществ. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A260/280) часто используют для оценки чистоты препарата. Чистая ДНК имеет соотношение A260/280 порядка 1,8, образец РНК без примесей A260/280 около 2.
Примеси белков и отношение 260:280
Для выявления примесей белков в растворах нуклеиновых кислот, анализируют соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм, так как ароматические аминокислоты в составе белков поглощают на 280 нм[1][4]. Однако влияние примесных белков на определение концентрации нуклеиновых кислот невелико — лишь при значительной концентрации белка соотношение 260:280 сдвигается существенно[1][5].
Отношение 260:280 позволяет определить примесь нуклеиновых кислот в растворах белков и примесей белков в растворах нуклеиновых кислот:
| % белка | % нуклеиновой кислоты | отношение 260:280 |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 0,57 |
| 95 | 5 | 1,06 |
| 90 | 10 | 1,32 |
| 70 | 30 | 1,73 |
Отношение 260:230 имеет меньшую чувствительность при определении примеси белка в растворе нуклеиновой кислоты:
| % нуклеиновой кислоты | % белка | отношение 260:230 |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 2,00 |
| 95 | 5 | 1,99 |
| 90 | 10 | 1,98 |
| 70 | 30 | 1,94 |
Такие отличия обусловлены более высоким значением коэффициента молярной экстинкции нуклеиновых кислот на длинах волн 260 и 280 нм в сравнении с белками. Поэтому даже для раствора белка относительно высокой концентрации вклад в поглощение на длинах волн 260 и 280 нм небольшой. Белковое загрязнение в растворе нуклеиновой кислоты не может быть определено по соотношению 260:230.
Другие загрязнения
- Загрязнения фенолом, который часто используют при выделении нуклеиновых кислот, может приводить к значительным погрешностям при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Фенол имеет максимальное поглощение на длине волны 270 нм и соотношение A260/280 около 1,2. Нуклеиновые кислоты, не содержащие фенол, имеют соотношение A260/280 около 2[1]. Примеси фенола могут значительно завысить концентрацию ДНК.
- Поглощение на длине волны 230 нм может быть вызвано загрязнениями фенолятами, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца РНК отношение A260/230 должно быть около 2, для чистого образца ДНК A260/230 около 1,8.[6]
- Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на другие загрязнения раствора. Поглощение на этих длинах волн для чистых препаратов нуклеиновых кислот должно быть равно нулю.
- Отрицательные значения могут быть вызваны неверным выбором раствора, использованного в качестве пустого (blank) либо быть следствием наличия флюоресцентного красителя в растворе.
Определение количества молекул ДНК или РНК с конкретными последовательностями нуклеотидов с помощью технологии SlipChip
Для диагностических целей часто надо определить количество той или иной ДНК или РНК. Разработаны высокочувствительные методы определения ДНК и РНК в микрообъёмах образцов — каплях не превышающих несколько пиколитров. Для этого используются микрожидкостные устройства для ПЦР с одной копии нуклеиновой кислоты[7][8][9][10].
Примечания
- ↑ 1 2 3 4 Sambrook and Russell. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (неопр.). — 3rd. — Cold Spring Harbor Laboratory Press[англ.], 2001. — ISBN 978-087969577-4.
- .
- ↑ Kartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, October 7), American Biotechnology Laboratory, http://www.iscpubs.com/Media/PublishingTitles/b0608kar.pdf
- ↑ Sambrook and Russell cites the original paper: Warburg, O. and Christian W. Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase (нем.) // Biochem. Z.[англ.] : magazin. — 1942. — Bd. 310. — S. 384—421.)
- ↑ Glasel J. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios (англ.) // BioTechniques[англ.] : journal. — 1995. — Vol. 18, no. 1. — P. 62—63. — PMID 7702855.)
- ↑ The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com (13 января 2010). Дата обращения: 12 марта 2010. Архивировано 6 сентября 2012 года.
- Available on 2017-01-26