GENCODE

GENCODE — проект геномных исследований, являющийся составной частью проекта «Энциклопедия элементов ДНК» (ENCODE)^[2].

GENCODE был создан в рамках пилотной фазы проекта

Конечная цель проекта — создание базы аннотаций, включающей все белок-кодирующие локусы с альтернативными транскриптами^[5], некодирующие локусы с обнаруженными транскриптами^[6] и псевдогены^[7].

История

В сентябре 2003 года Национальный институт исследований

В июне 2007 года пилотная фаза ENCODE была завершена[10]. Проект был признан удачным, и институт Сэнгера (Welcome Trust Sanger Institute) получил грант от NHGRI для масштабирования проекта GENCODE^[11].

В 2012 году был выпущен крупнейший релиз GENCODE 7 (на основе данных на момент декабря 2011 года), в котором была скомбинирована автоматическая аннотация Ensembl и аннотация вручную. С 2013 года GENCODE был удостоен второго гранта на продолжение работы по аннотации генома человека, а также на аннотацию мышиного генома для сравнительных исследований геномов мыши и человека^[11].

В апреле 2018 года была выпущена версия GENCODE 28 (содержащая данные, обработанные до ноября 2017 года)^[12].

Задачи

Задачи, решавшиеся в проекте GENCODE, вставали перед научным сообществом по мере расширения познаний в области генетики. Как правило, эти задачи были связаны с уточнением определений генетических терминов и с изучением функций геномных участков, ранее не подвергавшихся близкому рассмотрению. Ниже приведены примеры интересных вопросов и тем, которые исследуются в рамках GENCODE^[11].

Определение понятия «ген»

Задача определения понятия «ген» стоит перед учеными на протяжении всего времени с тех пор, как исследователи задумались о вопросах наследственности. В 1900-х годах ген рассматривался как некая дискретная единица наследственности, затем ген стали считать основой для биосинтеза белка, а в последнее время это понятие расширили до геномного фрагмента, транскрибирующегося в РНК^[13]. Хотя определение гена претерпело значительные изменения за последний век, оно осталось сложным и противоречивым предметом обсуждения для многих ученых. В ходе развития проектов ENCODE и, в частности, GENCODE, были подробнее описаны ещё более проблематичные аспекты определения — такие как альтернативный сплайсинг, межгенные участки, а также сложные паттерны рассеянной регуляции, консервативность некодирующих участков и обилие генов, продуцирующих некодирующие РНК. Поскольку глобальной целью проекта GENCODE является создание энциклопедии генов и генных вариантов, эти проблемы поставили проект перед необходимостью дать обновленное определение понятия гена^[13].

Псевдогены

Псевдогены — это белок-кодирующие (или сходные с ними) последовательности ДНК, в которых произошла делеция или сдвиг рамки считывания^[14]. В большинстве геномных баз данных их упоминают как побочные продукты аннотации более привычных белок-кодирующих последовательностей. Однако недавний анализ показал, что некоторые из псевдогенов не просто экспрессируются, но и функционируют, играя роль в различных биологических процессах^[15]. Чтобы разобраться со всеми сложностями описания псевдогенов, в рамках GENCODE исследователи создали онтологию псевдогенов с использованием автоматических, ручных и экспериментальных методов, чтобы связать воедино их различные свойства, в том числе свойства последовательности, эволюцию и возможную биологическую функцию^[4]. Количество аннотированных псевдогенов растет с каждой новой версией GENCODE (см. Основная статистика).

Длинные некодирующие РНК (lncRNA)

Одной из ключевых областей исследования проекта GENCODE является изучение биологического значения длинных некодирующих РНК (lncRNA). Для более глубокого понимания и изучения экспрессии lncRNA у человека, в рамках GENCODE был запущен подпроект для разработки пользовательских микрочипов для количественного определения таких транскриптов в аннотации lncRNA^[6]. Некоторое количество подобных платформ было создано с помощью системы Agilent Technologies eArray, они доступны в стандартном формате Аgilent^[16].

Датасет длинных некодирующих РНК, представленный в GENCODE (в частности, в версии GENCODE 7), считается самым большим из всех представленных датасетов lncRNA. При этом он мало перекрывается с другими существующими датасетами^[6]. Транскрипты, аннотированные как lncRNA, далее могут быть классифицированы на следующие типы на основе их положения в геноме относительно белок-кодирующих генов:

1. Антисмысловая РНК: локус, для которого был найден хотя бы один транскрипт, перекрывающийся с экзоном белок-кодирующего гена на противоположной цепи, или есть опубликованные данные об антисмысловой регуляции какого-либо гена;
2. Длинная межгенная некодирующая РНК (lincRNA^[17]);
3. «Перекрывающийся»: локус, содержащий белок-кодирующий ген внутри интрона на той же цепи;
4. «Интронный»: локус, расположенный внутри интрона, но не перекрывающийся с экзонами на той же цепи;
5. Процессированный транскрипт: локус, для которого ни один транскрипт не содержит открытую рамку считывания, и который не может быть отнесен ни к одной из предыдущих категорий из-за сложной структуры.

Основные участники

В таблице приведены институты, чье участие было анонсировано на сайте GENCODE^[18].

Основная статистика

Полнота данных в аннотациях GENCODE непрерывно растёт. Ниже приведена статистика версии GENCODE 28^[19]. Эта версия соответствует выпуску Ensembl 92 и содержит аннотацию, сделанную по сборке человеческого генома GRCh38, но доступную также для сборки GRCh37).

Сравнение версий GENCODE

Сравнительная статистика четырёх основных релизов GENCODE продемонстрирована на графике справа^[20].

Данные свидетельствуют о том, что покрытие генома (количество обнаруженных и аннотированных локусов) стабильно увеличивается. При этом доля белок-кодирующих генов среди аннотированных уменьшается — в основном, из-за результатов аннотирования

В проекте GENCODE применялись ручная и автоматическая аннотация. При верификации результатов использовались данные лабораторных экспериментов[21].

Автоматическая аннотация (ENSEMBL)

Информация о транскриптах

мРНК из публичных баз данных^[22]. Помимо белок-кодирующих участков, аннотировались нетранслируемые участки, длинные некодирующие РНК и короткие некодирующие РНК^[4].

HAVANA (Human and Vertebrate Analysis and Annotation) — исследовательская группа, осуществляющая ручную аннотацию транскриптов в проекте GENCODE[3]^[4].

Помимо группы HAVANA, в состав консорциума GENCODE входило ещё несколько групп, проводивших анализ аннотированных локусов с помощью программ

Помимо официально вовлечённых в проект групп, над улучшением качества аннотации GENCODE работали независимые исследователи[26].

Объединение ручной и автоматической аннотаций

При объединении все модели транскриптов, полученные автоматической и ручной аннотацией, сравнивались для перекрывающихся транскриптов. Найденные расхождения детектировались с использованием системы AnnoTrack^[4].

Автоматическая аннотация не всегда может считаться корректной (так, только в 45 % случаев автоматической аннотации корректно предсказываются все альтернативные транскрипты^[4]). В случае несовпадения аннотаций приоритетной являлась аннотация HAVANA, так как ручная аннотация в сложных случаях предполагала анализ геномного контекста, литературы и использование экспериментальных данных Mus musculus. Тем не менее, для таких случаев сохраняется информация, полученная обоими способами аннотации^[4].

Оценка качества

Транскриптам присваивается определённый уровень поддержки на основании сравнения транскрипта GENCODE с выравниванием мРНК и маркерных экспрессирующихся последовательностей (EST), полученным из Ensembl и UCSC. В итоге аннотации каждого транскрипта делятся на определённые вручную, автоматически или слитые аннотации, то есть те, для которых и автоматический метод, и метод аннотирования вручную дали одинаковые результаты^[4].

Основные подходы, использованные в GENCODE 7

Амплификация, секвенирование, картирование и валидация результатов

С помощью амплификации

Прочие подходы

Для аннотации альтернативных транскриптов генов использовался веб-сервис APPRIS (CNIO). APPRIS выбирает один вариант в качестве «главной изоформы» на основании информации о белковом продукте гена и об

Текущая версия набора генов человека в GENCODE включает файлы аннотаций (в форматах GTF и GFF3), FASTA-файлы и файлы METADATA, связанные с аннотацией GENCODE для всех геномных участков^[12]. Они соотнесены с референсной хромосомой и хранятся в отдельных файлах, которые содержат: генную аннотацию, сайты полиаденилирования, аннотированные группой HAVANA, псевдогены, предсказанные алгоритмами Йельского университета и университета Санта-Круз (США), длинные некодирующие РНК, а также структуры тРНК, предсказанные tRNA-Scan ^[12].

Определение уровня аннотации

Все гены датасета GENCODE классифицируются на три категории в соответствии с типом аннотации^[4]:

• Уровень 1 (подтвержденный локус): включает транскрипты, которые были аннотированы вручную и проверены экспериментально с помощью RT-PCR — секвенирования, а также псевдогены, подтвержденные тремя разными методологиями^[4].
• Уровень 2 (аннотированный вручную локус): к нему относятся транскрипты, аннотированые только вручную группой HAVANA, а также транскрипты, совмещенные с моделями, полученными по автоматическому протоколу Ensembl^[4].
• Уровень 3 (автоматически аннотированный локус): отражает транскрипты или псевдогены, предсказанные только с помощью автоматической аннотации Ensembl^[4].

Определение статуса гена/транскрипта

Генам и транскриптам присваиваются статусы «известный», «новый» и «предполагаемый» в зависимости от их представленности в других основных базах данных и от оснований, использованных для построения составляющих их транскриптов^[4].

Известный («known»): представлен в базах данных HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) и RefSeq^[4].

Новый («novel»): не представлен в базах HGNC или RefSeq, но хорошо подтверждается либо транскриптом, специфичным для данного локуса, либо свидетельствами его присутствия в паралогичном или ортологичном локусе^[4].

Предполагаемый («putative»): не представлен в базах НGNC или RefSeq, но подтверждается признаками существования более короткого и редкого транскрипта^[4].

Связанные с GENCODE проекты

Ensembl

Проект Ensembl является важной частью проекта ENCODE и представляет собой геномный браузер, позволяющий визуализировать сборку генома и все данные проекта ENCODE, в частности, аннотированные в проекте GENCODE геномные участки^[28].

RGASP

RGASP (The RNA-seq Genome Annotation Assessment Project) — проект, организованный в рамках консорциума GENCODE после семинара EGASP (ENCODE Genome Annotation Assessment Project) по предсказанию генов. Было проведено две сессии семинаров для анализа результатов секвенирования РНК, а также рассмотрения его различных (методических и технических) аспектов. Одной из наиболее существенных находок первых двух стадий проекта стала важность соотнесения чтения с качеством полученного предсказания гена. В 2014 году была проведена третья сессия семинаров RGASP, где основное внимание было уделено картированию чтений на геном. Проект предоставил софт для аннотации транскриптов (определение, реконструкция и расчет количества транскриптов)^[29].

Примечания

Ссылки

• Официальный сайт проекта GENCODE
• ENCODE
• Официальный сайт проекта Ensembl
• Проект «Геном человека»

Эта статья входит в число хороших статей русскоязычного раздела Википедии.