Сборка Golden Gate
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/f/f1/Golden_Gate_assembly.svg/250px-Golden_Gate_assembly.svg.png)
Сборка Golden Gate, также клонирование Golden Gate (
В отличие от таких наиболее распространённых рестриктаз, как
Обычный протокол амплификатора задаёт температурные колебания от 16 °C (оптимальной для лигаз) до 37 °C (оптимальной для ферментов рестрикции)[4]. Этот метод синтеза может быть использован как для одиночной бесшовной вставки, так и для сборки нескольких фрагментов ДНК в одной пробирке[5].
Бесшовная сборка
Сравнение с альтернативными методами
Последовательности, содержащие «швы» (следы применения систем клонирования), часто образуются в результате сборки большого числа фрагментов. Например, в методе мультисегментной сборки Gateway[англ.] фрагменты ДНК добавляются в донорный фрагмент вместе с дополнительными последовательностями att, которые совпадают в соседних сегментах. Это приводит к тому, что в конечном продукте фрагменты ДНК разделены последовательностями att[6]. В сборке BioBrick в промежутках между фрагментами ДНК, добавленными в плазмиду, остаётся восьминуклеотидный «шов», кодирующий тирозин и стоп-кодон[6].
Преимущества метода Golden Gate
При синтезе Golden Gate используются рестриктазы типа IIs, разрезающие последовательность ДНК вне своего сайта узнавания[6]. Один и тот же фермент рестрикции IIs типа может создавать различные липкие концы для разных последовательностей ДНК. В частности, с помощью фермента BsaI теоретически возможно получить каждый из 256 вариантов липких концов (длина 4 пары нуклеотидов) при наличии соответствующих фрагментов ДНК[6]. При корректном синтезе участков липких концов эти фрагменты соединяются без «швов» между частями. В некоторых случаях конечный продукт может быть условно бесшовным — сайты узнавания рестриктаз могут быть оставлены с обеих сторон от мультифрагментной вставки в донорную ДНК для вырезания целого фрагмента на следующих этапах[6]. Так как дополнительные фрагменты ДНК могут быть вставлены в векторы без «швов» внутри открытой рамки считывания, метод Golden Gate широко используется в белковой инженерии[6].
Архитектура плазмиды
Несмотря на то, что синтез Golden Gate ускоряет мультисегментную сборку, для повышения выхода полезно применять специальные архитектуры плазмиды[5]. На каждом шаге метод Golden Gate способен осуществить сборку до девяти фрагментов ДНК. При этом требуется, чтобы липкие концы соседних объединяемых фрагментов ДНК были гомологичны друг другу, а сайты узнавания фермента рестрикции не включались в вырезаемые фрагменты[5]. После того, как фрагменты лигируются ДНК-лигазой бактериофага T4, продукт не будет содержать сайтов узнавания рестриктазы IIS и не будет разрезан повторно в дальнейшем ходе реакции[5]. В свою очередь, нелигированные сайты, наоборот, могут взаимодействовать с рестриктазой, тем самым добавляя больше фрагментов в реакционную смесь[5]. При корректной постановке эксперимента и выборе фрагментов ДНК линейный продукт может быть получен за один цикл[5].
Стандарты клонирования
Сборка последовательности ДНК при помощи ферментов рестрикции регулируется различными стандартами клонирования с целью минимизировать снижение эффективности клонирования и нарушения функций плазмиды. Такие эффекты могут быть вызваны некорректной сборкой, например, при наличии непредусмотренных сайтов рестрикции внутри вставки или вектора[7].
Для клонирования Golden Gate стандартами предусмотрено два этапа[7]. На первом этапе происходит сборка моногенной последовательности из таких элементов, как промотор, открытые рамки считывания и терминатор[7]. После этого на втором этапе сборки происходит объединение нескольких моногенных последовательностей, полученных на первом этапе[7]. Для осуществления сборки Golden Gate, состоящей из 2 этапов и более, применяются системы стандартов MoClo (modular cloning) и GoldenBraid[7].
Стандарт MoClo
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/80/%D0%A3%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%BD%D0%B8_%D1%8D%D0%BB%D0%B5%D0%BC%D0%B5%D0%BD%D1%82%D0%BE%D0%B2_%D0%BA%D0%BB%D0%BE%D0%BD%D0%B8%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%8F_Golden_Gate.svg/340px-%D0%A3%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%BD%D0%B8_%D1%8D%D0%BB%D0%B5%D0%BC%D0%B5%D0%BD%D1%82%D0%BE%D0%B2_%D0%BA%D0%BB%D0%BE%D0%BD%D0%B8%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D1%8F_Golden_Gate.svg.png)
Стандарт MoClo разделяет генетические элементы на 4 разных уровня:
- Уровень −1 включает домены и другие составные части генетических элементов;
- Уровень 0 включает в себя стандартные отдельные генетические элементы: промотор, 5'-нетранслируемый участок (UTR), белок-кодирующую последовательность и терминатор;
- Уровень 1 включает в себя полностью собранные гены;
- Уровень 2 включает последовательности из нескольких собранных генов. Также существуют вариации уровня 2: уровни M и P.
MoClo использует параллельный подход, при котором во всех полученных модулях уровня 0 присутствуют сайты рестрикции BpiI с обеих сторон от вставки. Вектор, в который будут добавлены гены, имеет два инвертированных сайта узнавания рестриктазы BsaI и вырезаемый селекционный маркер между ними.[7] Зачастую в качестве такого маркера выступает ген lacZ, позволяя производить отрицательный отбор плазмид, в которых репортёрный ген был успешно заменён на собранную ДНК[7]. Участки липких концов каждого модуля уровня 0 и целевого вектора должны быть комплементарны только липким концам соседнего фрагмента, при этом последовательность сочетаний липких концов определяет архитектуру конечного продукта[7]. Сборка Golden Gate обычно начинается с модулей уровня 0, содержащих отдельные гены[5]. Для того чтобы выявить непредусмотренные сайты рестрикции, необходимо провести секвенирование модулей уровня 0[5]. Однако если модули уровня 0 слишком велики, сборку необходимо начать с последовательностей уровня −1, которые также необходимо отсеквенировать[5]. Если же сборка была начата с фрагментов уровня −1, модули уровня 0 секвенировать заново не нужно[5].
Уровень −1
Фрагменты уровня −1 используются при сборке длинных модулей уровня 0[5]. Для получения и наработки таких фрагментов обычно используется лигирование последовательностей с тупыми концами и последующая ПЦР[5]. Целевой вектор не должен содержать сайтов узнавания рестриктазы типа IIs, которая используется на следующем этапе сборки[5].
Уровень 0
Модули уровня 0 являются основой системы MoClo, так как они содержат полные генетические элементы, как промотор, 5'-нетранслируемый участок (UTR), белок-кодирующую последовательность и терминатор[5]. Для успешного проведения сборки Golden Gate внутренние последовательности модулей уровня 0 не должны содержать сайтов узнавания рестриктаз IIs BsaI, BpiI и Esp3I, но должны быть фланкированы (т. е. обрамлены) двумя сайтами рестрикции BsaI в обратной ориентации[5].
Если в результате секвенирования было обнаружено, что модуль уровня 0 содержит нежелательный сайт рестрикции, то тот может быть промутирован in silico путём удаления или замены одного нуклеотида[5]. При этом необходимо убедиться в том, что внесённая мутация не повлияет на свойства синтезируемого с ДНК продукта (обычно РНК или белка)[5]. В белок-кодирующую последовательность рекомендуется вносить синонимичные мутации, так как они не изменяют последовательность синтезируемого белка и, следовательно, не влияют на функцию гена[5].
Уровень 1
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/89/%D0%A1%D0%B1%D0%BE%D1%80%D0%BA%D0%B0_%D1%83%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%BD%D1%8F_1_Golden_Gate.svg/200px-%D0%A1%D0%B1%D0%BE%D1%80%D0%BA%D0%B0_%D1%83%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%BD%D1%8F_1_Golden_Gate.svg.png)
Целевой вектор уровня 1 определяет местоположение и направление вставляемой конструкции[8]. В таком векторе ген селекционного маркера (lacZ) фланкирован двумя сайтами рестрикции с каждой стороны. При этом внутренний сайт (BsaI) инвертирован, а внешний сайт (BpiI) расположен в прямой ориентации. Существует 14 вариантов вектора уровня 1, в которых отличаются последовательности липких концов для внешних сайтов, но не отличаются последовательности липких концов внутренних сайтов[8]. Таким образом, корректно составленный набор модулей уровня 0 можно заклонировать в любой из этих векторов[8].
Векторы уровня 1 используются для временной экспрессии в растениях, запускаемой Agrobacterium[8].
Уровень 2
![](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/46/%D0%A1%D0%B1%D0%BE%D1%80%D0%BA%D0%B0_%D1%83%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%BD%D1%8F_2_Golden_Gate_.svg/200px-%D0%A1%D0%B1%D0%BE%D1%80%D0%BA%D0%B0_%D1%83%D1%80%D0%BE%D0%B2%D0%BD%D1%8F_2_Golden_Gate_.svg.png)
В целевых векторах уровня 2 присутствует 2 инвертированных сайта узнавания рестриктазы BpiI для вставки модулей уровня 1[8]. Сайт рестрикции в векторе перед местом вставки должен быть комплементарен сайту перед началом гена в модуле уровня 1, сайт рестрикции после места вставки универсален[8]. При каждом клонировании в вектор может быть вставлено от 2 до 6 генов[8].
Добавление большего числа генов за один шаг нежелательно, так как это, скорее всего, может привести к неправильной сборке из-за неправильных сочетаний липких концов[8].
Таким образом, сборку конструкций, состоящих из более чем 6 генов, необходимо осуществлять в несколько этапов. Для этого необходимы линкерные концевые последовательности, которые содержат сайты узнавания рестриктазы BsaI или BsmBI в инвертированном положении и новый селекционный маркер (синий или фиолетовый)[8]. На каждом этапе необходимо менять рестриктазу и маркер[8]. При скрининге цвет колоний[англ.], содержащих корректно собранный вектор, будет меняться на каждом этапе сборки (синий — фиолетовый), но на последнем шаге при использовании закрывающего концевого линкера цвет колоний будет белым[8].
Уровень M
Целевые векторы уровня M похожи на векторы уровня 2 за исключением наличия сайта BsaI перед парой инвертированныз сайтов BpiI[9]. Когда один или несколько генов клонируются в вектор уровня M, второй сайт рестрикции BsaI добавляется специальной (M) линкерной концевой последовательностью. Благодаря этому, фрагмент, содержащий все собранные гены, может быть вырезан и использован на следующем этапе клонирования (уровне P)[8].
Уровень P
Целевые векторы уровня P похожи на таковые уровня M, но сайты BpiI заменены на BsaI, а сайты BsaI заменены на BpiI. Несколько конструкций уровня M с совместимыми липкими концами могут быть клонированы в целевой вектор P за один этап. В теории возможна сборка до 36 генов в одну конструкцию при запуске 6 параллельных реакций уровня M (по 6 генов в каждой), но на практике обычно происходит сборка меньшего числа генов из-за того, что в большинстве проектов не требуются настолько большие конструкции[8]. Несмотря на это, векторы уровней M и P устроены таким образом, что гены, клонированные в вектор уровня P, могут быть клонированы далее в вектор уровня M и наоборот[8].
GoldenBraid
По стандартному протоколу Golden Gate, сайты рестрикции, использованные на предыдущем этапе клонирования, становятся недоступными[10]. Для сборки более чем 6 генов требуется другой фермент рестрикции типа IIs и внесение соответствующих ему сайтов узнавания[10]. Это можно осуществить с помощью векторов уровней 2 или уровней M и P. GoldenBraid предоставляет вариацию системы уровней M и P.
Для клонирования по методу GoldenBraid применяется система из 4 плазмид, способных к формированию двойной петли (т. н. «гирлянды» — «braid»). Такая система допускает бинарную сборку сразу нескольких конструкций[10].
Golden Mutagenesis
Метод сборки Golden Gate также может быть использован для проведения мутагенеза (Golden Mutagenesis). Эту технологию легко применить благодаря доступным онлайн инструментам для подбора праймеров (GoldenMutagenesis web tool (англ.).) и векторов[11].
Примечания
- .
- ↑ Biolabs, New England Golden Gate Assembly | NEB (англ.). www.neb.com. Дата обращения: 26 апреля 2017. Архивировано 15 апреля 2019 года.
- ↑ .
- .
- ↑ .
- ↑ .
- ↑ 19 июля 2018 года.
- ↑ .
- .
- ↑ .
- ↑ Pascal Püllmann, Chris Ulpinnis, Sylvestre Marillonnet, Ramona Gruetzner, Steffen Neumann (2019-07-29), "Golden Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design", Scientific Reports (англ.), vol. 9, no. 1, pp. 1–11, doi:10.1038/s41598-019-47376-1, ISSN 2045-2322, Дата обращения: 5 марта 2020
{{citation}}
: Википедия:Обслуживание CS1 (множественные имена: authors list) (ссылка) Архивная копия от 21 сентября 2021 на Wayback Machine
Эта статья входит в число добротных статей русскоязычного раздела Википедии. |