Протеомика
Протео́мика (
Объектом изучения протеомики являются белки, которые
Задачи и значение
После
Данные, полученные методом протеомики, могут быть использованы для формирования более глубокого понимания причин возникновения разнообразных заболеваний, например,
Методы
Традиционный подход к изучению белков подразумевает их выделение из
Количественный анализ, не требующий информации о структурах белков
Количественный анализ белков с
Секвенирование последовательности белка
В 1953 году
В 1950-х годах
В 1960-х годах был создан автоматический секвенатор, реализующий метод Эдмана. Первичную структуру инсулина, на определение которой у Сенгера ушло более 10 лет, в настоящее время можно получить за пару дней прямым секвенированием на белковом секвенаторе[7]. Метод Эдмана сейчас изредка используют при исследовании организмов, геномные последовательности которых неизвестны[8][9][10]. Традиционное секвенирование белков также применяют в тех случаях, когда многие их особенности (например, посттрансляционные модификации) нельзя узнать только лишь из последовательности гена[11].
Большинство белков перед секвенированием необходимо приготовить к нему особым образом. Сначала в белке́ разрушают
Для определения положения дисульфидных связей белок снова расщепляют трипсином, но не разрушая предварительно дисульфидные связи. Образующиеся фрагменты разделяют электрофорезом и сравнивают с набором фрагментов, полученных при первом расщеплении трипсином. Если между двумя фрагментами есть дисульфидная связь, то при разделении первого набора фрагментов они будут выглядеть на геле как две полосы, а при электрофорезе второго образуют единую полосу[13].
Двумерный гель-электрофорез
В 1970—1980-х годах достигли расцвета методы выделения и очистки белков. Эти методы сочетали принципы хроматографии,
Метод Лэммли получил дальнейшее развитие. В 1975 году Патрик О’Фарелл и Йоахим Клозе независимо друг от друга предложили принцип так называемого
Вестерн-блоттинг
В ряде случаев необходимо установить, с какими клеточными белками взаимодействуют выделенные антитела. Нередко стоит и обратная задача: определить выделенный белок можно с помощью антител, специфически с ним связывающихся. Для этого существует метод вестерн-блоттинга, или иммуноблоттинга. При его применении вначале белки из исследуемого лизата разделяют при помощи гель-электрофореза, а из геля переносят на пористую мембрану. Далее мембрану последовательно обрабатывают антителами, специфичными к искомому белку, и радиоактивно-меченными антителами, связывающимися с первыми антителами. Иногда вместо вторых антител производят ферментативную реакцию с первыми антителами. В результате молекулы искомого белка, распознанные антителами, выявляются как полосы на авторадиограмме или пятна на мембране, по которым можно идентифицировать белок[18][19].
Масс-спектрометрия
Масс-спектрометрия включает ряд методов, которые направлены на определение
Из-за особенностей изотопного разделения пики в спектрах больших белков чрезвычайно сложно анализировать. По этой причине перед исследованием их с помощью фермента
Набор молекулярных масс пептидов, которые были получены при обработке белка трипсином, уникален для каждого белка. Это связано в основном с высокой специфичностью трипсина, который вносит разрез только по остаткам лизина и аргинина. Сравнивая полученную картину молекулярных масс пептидов для исследуемого белка с пептидными картами белков из баз данных, можно установить, какой именно белок исследовался. Этот подход получил название пептидной дактилоскопии[23]. Поскольку полного соответствия экспериментального распределения масс пептидов и эталонных пептидных карт достичь невозможно, была введена количественная оценка (англ. score) вероятности того, что экспериментальная пептидная карта соответствует данной теоретической. Для пептидной дактилоскопии были разработаны специальные программы, например, MOWSE[24].
Вместо фрагментации трипсином перед установкой образцов в
В качестве альтернативы MALDI ионизацию пептидов перед масс-спектрометрией можно осуществлять с помощью метода ионизации электрораспылением, или ионизации
Методы масс-спектрометрии могут быть использованы для направленного обнаружения искомых белков, то есть масс-спектрометр можно настроить таким образом, чтобы он видел только нужный пептид. Для этой цели используют прибор с детектором типа тройного квадруполя[англ.], то есть три одинаковых масс-спектрометра, последовательно передающие друг другу ионы. Первый масс-спектрометр отфильтровывает интересующий пептид, во втором он фрагментируется, а третий регистрирует от 3 до 5 заранее выбранных фрагментов. Количественный анализ производится на основе интенсивности фрагментов. Этот метод известен как мониторинг множественных реакций (англ. multiple reaction monitoring, MRM), или мониторинг выбранных реакций[англ.] (англ. selected reaction monitoring, SRM)[28].
Белок-белковые взаимодействия
Один из наиболее популярных методов изучения белок-белковых взаимодействий — использование
На основании данных о белок-белковых взаимодействиях в ряде случаев можно судить о функциях белка. Например, если известно, что белок взаимодействует с несколькими белками одного
Данные о белок-белковых взаимодействий чрезвычайно важны для биологических сетей и системной биологии: они, например, используются при реконструкции сигнальных каскадов[33][34].
Белковые микрочипы
Белковые микрочипы разрабатываются для идентификации определённых белков в образце. По аналогии с ДНК-микрочипами, на твёрдую подложку наносятся очень маленькие капли, содержащие антитела. В каждой капле находятся меченые антитела к одному определённому белку, который добавляется на чип в виде флуоресцентно-меченной[англ.] пробы. После промывки флуоресценция детектируется только в тех каплях, в которых антитела связали исследуемый белок. Вместо антител можно использовать другие молекулы, специфически взаимодействующие с конкретными белками, например, олигонуклеотиды[35]. Белковые микрочипы также можно использовать для обнаружения белок-белковых взаимодействий и определения функций белков. В 2000-е годы белковые микрочипы автоматизированы. Они обладают высокой чувствительностью и требуют совсем небольшого количества исследуемого белка, благодаря чему отличаются экономичностью[36].
Биоинформатика в протеомике
С помощью масс-спектрометрии и чипов можно получить информацию о фрагментах белка, но не о белке целиком. В связи с этим созданы программы, которые из фрагментарных данных масс-спектрометрии и чипов выдают данные о почти полностью собранных из этих фрагментов белков. Эти программы основаны на построении выравниваний фрагментов с известными белками из баз данных UniProt[37] и PROSITE[англ.][38].
В большинстве программ, анализирующих белки, не учитываются их посттрансляционные модификации[39]. Существующие инструменты, определяющие посттрансляционные модификации, имеют лишь предсказательный характер[40].
Вычислительные методы биоинформатики активно используются для изучения белков-биомаркеров. Так, с помощью компьютерных моделей удалось показать интенсивный обмен белками между организмом матери и плодом при беременности, причём для анализа требовался лишь неинвазивный забор крови у матери[41].
Развивается такое направление, как протеогеномика, которая использует методы протеомики для подтверждения данных, полученных из геномных последовательностей[42][43]. Существует также структурная протеомика, которая занимается широкомасштабным исследованием структур белков на основе данных рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии[44].
Протеомика и системная биология
Последние достижения в количественной протеомике позволяют использовать её для глубокого анализа клеточных систем[33][34]. Описание поведения биологических систем в ответ на разнообразные воздействия (действия внешних факторов, изменения клеточной физиологии в связи с разными фазами клеточного цикла и тому подобные) на уровне изменения белкового состава позволяют глубже понять суть многих биологических процессов. Благодаря этому протеомику, наряду с геномикой, транскриптомикой, эпигеномикой, метаболомикой и другими «-омиками»[англ.], включают в состав нового научного направления — системной биологии. Так, Атлас протеома раковых клеток (англ. The Cancer Proteome Atlas) содержит количественные данные об экспрессии около 200 белков в более чем 4000 проанализированных опухолевых образцах, дополняя Атлас ракового генома (англ. The Cancer Genome Atlas), содержащий геномные и транскриптомные данные для этих белков[45].
Практическое применение
С помощью MALDI-TOF можно определять
Исследуется возможность использования протеомики для диагностики
Новейшие достижения протеомики — в области масс-спектрометрии, разделении белков
Многие лекарственные препараты или сами являются белками, или действуют на определённые белки. Поэтому протеомику взяли на вооружение специалисты, занимающиеся .
Сравнение протеомов двух организмов (необязательно близкородственных) позволяет выявить как общие для этих двух организмов белки, так и белки, которые обусловливают различия их
История
История протеомики начинается с 1950 года, когда Эдман предложил метод секвенирования белков. В 1958 году исследовательская группа
Примечания
- ↑ James P. Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. (англ.) // Quarterly Reviews Of Biophysics. — 1997. — November (vol. 30, no. 4). — P. 279—331. — PMID 9634650.
- ↑ 1 2 Уилсон и Уолкер, 2015, с. 438.
- ]
- ↑ Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. — М.: ТЕХНОСФЕРА, 2005. — С. 185. — 256 с. — ISBN 94836-044-X.
- doi:10.1172/JCI110380.]
- ↑ Нельсон и Кокс, 2017, с. 143—145.
- ↑ 1 2 Нельсон и Кокс, 2017, с. 145.
- ]
- ↑ Edman P., Begg G. A protein sequenator. (англ.) // European Journal Of Biochemistry. — 1967. — March (vol. 1, no. 1). — P. 80—91. — PMID 6059350.
- ]
- ↑ Нельсон и Кокс, 2017, с. 143.
- ↑ Нельсон и Кокс, 2017, с. 145—147.
- ↑ Нельсон и Кокс, 2017, с. 147.
- doi:10.1038/227680a0.]
- ↑ O'Farrell P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. (англ.) // The Journal Of Biological Chemistry. — 1975. — 25 May (vol. 250, no. 10). — P. 4007—4021. — PMID 236308.
- ↑ Klose J. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. (англ.) // Humangenetik. — 1975. — Vol. 26, no. 3. — P. 231—243. — PMID 1093965.
- ]
- ↑ Renart J., Reiser J., Stark G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1979. — July (vol. 76, no. 7). — P. 3116—3120. — PMID 91164.
- ↑ Уилсон и Уолкер, 2015, с. 368—369.
- ↑ Hillenkamp F., Karas M., Beavis R. C., Chait B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. (англ.) // Analytical Chemistry. — 1991. — 15 December (vol. 63, no. 24). — P. 1193—1203. — PMID 1789447.
- ]
- ]
- ↑ Shevchenko A., Jensen O. N., Podtelejnikov A. V., Sagliocco F., Wilm M., Vorm O., Mortensen P., Shevchenko A., Boucherie H., Mann M. Linking genome and proteome by mass spectrometry: large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. (англ.) // Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. — 1996. — 10 December (vol. 93, no. 25). — P. 14440—14445. — PMID 8962070.
- ↑ Pappin D. J., Hojrup P., Bleasby A. J. Rapid identification of proteins by peptide-mass fingerprinting. (англ.) // Current Biology : CB. — 1993. — 1 June (vol. 3, no. 6). — P. 327—332. — PMID 15335725.
- doi:10.1038/nmeth1019.]
- ↑ Pitt J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. (англ.) // The Clinical Biochemist. Reviews. — 2009. — February (vol. 30, no. 1). — P. 19—34. — PMID 19224008.
- ↑ Alves P., Arnold R. J., Novotny M. V., Radivojac P., Reilly J. P., Tang H. Advancement in protein inference from shotgun proteomics using peptide detectability. (англ.) // Pacific Symposium On Biocomputing. Pacific Symposium On Biocomputing. — 2007. — P. 409—420. — PMID 17990506.
- ]
- ↑ Уилсон и Уолкер, 2015, с. 446—447.
- ]
- ]
- ↑ Уилсон и Уолкер, 2015, с. 446.
- ↑ ]
- ↑ ]
- ↑ Weston A. D., Hood L. Systems biology, proteomics, and the future of health care: toward predictive, preventative, and personalized medicine. (англ.) // Journal Of Proteome Research. — 2004. — March (vol. 3, no. 2). — P. 179—196. — PMID 15113093.
- doi:10.1038/nbt0302-225.]
- ↑ UniProt . www.uniprot.org. Дата обращения: 6 ноября 2018. Архивировано 15 декабря 2020 года.
- ↑ ExPASy — PROSITE . prosite.expasy.org.
- ]
- ]
- ]
- ]
- ]
- ↑ What is Proteomics? ProteoConsult. Дата обращения: 6 ноября 2018. Архивировано 29 апреля 2021 года.
- ]
- ]
- ]
- ↑ 1 2 Tomislav Meštrović. Proteomics uses . Дата обращения: 30 ноября 2018. Архивировано 1 декабря 2018 года.
- ]
- ]
- ↑ Сергей Мошковский. 12 методов в картинках: протеомика . Биомолекула. Дата обращения: 30 августа 2018. Архивировано 31 августа 2018 года.
- ]
Литература
- Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии / К. Уилсон и Дж. Уолкер. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2015. — 848 с. — ISBN 978-5-9963-1895-7.
- Нельсон Дэвид, Кокс Майкл. Основы биохимии Ленинджера. В 3 т. — М.: Лаборатория знаний, 2017. — Т. 1. — ISBN 978-5-00101-014-2.
Эта статья входит в число хороших статей русскоязычного раздела Википедии. |