Эта статья входит в число хороших статей

Морфолиновые олигонуклеотиды

Материал из Википедии — свободной энциклопедии
Стабильная версия, проверенная 2 октября 2023.
Фрагмент гетеродуплекса морфолинового олигонуклеотида и РНК

Морфоли́новые олигонуклеоти́ды

РНК. Морфолиновые олигонуклеотиды служат исследовательскими инструментами в обратной генетикe для нокдауна гена
.

Нокдаун гена заключается в предотвращении синтеза

мышей, данио-рерио, лягушек и морских ежей[7]
.

Разрабатываются пути применения морфолиновых олигонуклеотидов в

генетических заболеваний[10]
.

Структура

Морфолиновые олигонуклеотиды — это синтетические молекулы, представляющие собой измененные нуклеиновые кислоты

фосфатные, а фосфородиамидатные группы. Замена отрицательно заряженных фосфатных групп незаряженной фосфородиамидатной группой устраняет ионизацию при физиологических значениях рН, так что в живых клетках эти молекулы не заряжены. Вся молекула морфолинового олигонуклеотида состоит из таких изменённых нуклеотидов[11]
.

Функции

Механизмы действия морфолиновых олигонуклеотидов

Нормальная экспрессия гена
Трансляция заблокирована морфолиновым олигонуклеотидом
Сплайсинг заблокирован морфолиновым олигонуклеотидом

Морфолиновые олигонуклеотиды не вызывают деградации своей РНК-мишени, в отличие от многих антисмысловых молекул (например,

Fundulus heteroclitus или доставляют эти молекулы путём электропорации в зародыши курицы на более поздних стадиях развития[15]; обработанные таким образом зародыши называют морфантами. При наличии в цитозоле правильных систем доставки морфолиновых олигонуклеотидов могут быть эффективными и в культурах клеток[16][17]
.

Блокирование трансляции

Связываясь с

5'-нетранслируемой областью мРНК, морфолиновые олигонуклеотиды могут мешать рибосоме в комплексе с эукариотическими факторами инициации трансляции[англ.] двигаться от кэпа к старт-кодону. Это предотвращает трансляцию кодирующей области транскрипта-мишени (нокдаун гена). Такой приём очень удобен, когда исследователь хочет определить функцию конкретного белка; по эффектам, оказываемым нокдауном гена на клетку или организм, судят о функции белка. Некоторые морфолиновые олигонуклеотиды блокируют экспрессию столь эффективно, что после деградации белка, синтезированного до введения олигонуклеотидов, этот белок становится неопределимым при помощи вестерн-блоттинга[18]
.

Изменение сплайсинга пре-мРНК

Морфолиновые олигонуклеотиды могут вмешиваться в процессинг пре-мРНК следующими способами:

  • предотвращая связывание направляющих сплайсинг малых ядерных рибонуклеопротеинов (snRNP[англ.]) со своими мишенями на границах интронов в пре-мРНК;
  • блокируя остаток аденина, осуществляет нуклеофильную атаку в ходе сплайсинга и образует структуру лассо;
  • мешая связыванию регуляторных белков сплайсинга, таких как сайленсеры[19] и энхансеры сплайсинга[англ.][20].

Предотвращение связывания

рибонуклеопротеинов U1[англ.] (в сайте-доноре) или U2[англ.]/U5[англ.] (в полипиримидиновом тракте[англ.] или сайте-акцепторе) может привести к модифицированному сплайсингу, при котором из зрелой мРНК исключаются экзоны. Воздействие на другие сайты сплайсинга приводит к включению интронов в зрелую мРНК, в то время как активация скрытых сайтов сплайсинга может приводит и к включениям, и к исключениям[21]. Морфолиновые олигонуклеотиды могут также блокировать мишени snRNP U11[англ.]/U12[англ.][22]. Изменения в сплайсинге удобно отслеживать при помощи ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) и электрофореза (при электрофорезе продуктов RT-PCR наблюдается смещение полос в геле)[6]
.

Другие применения

Морфолиновые олигонуклеотиды использовались для блокировки активности

рибозимов[27], а также функционирование snRNP U2 и U12[28]. Морфолиновые олигонуклеотиды, нацеленные на «оголённые» последовательности мРНК в пределах кодирующей области, могут вызывать сдвиг рамки считывания[англ.] при трансляции[29]. Они также могут блокировать редактирование РНК. Эффективность морфолиновых олигонуклеотидов по отношению ко многим мишеням делает их универсальным средством для подавления взаимодействия белков или нуклеиновых кислот с мРНК[30]
.

Специфичность, стабильность и не-антисмысловые эффекты

Морфолиновые олигонуклеотиды стали стандартным инструментом для нокдауна генов в эмбриональных системах животных, в которых экспрессируется больше генов, чем во взрослых клетках. После инъекции морфолинового олигонуклеотида в зародыши лягушки или рыбы на стадии одной или нескольких клеток наибольший эффект проявляется к пятому дню[31], когда большая часть органогенеза и дифференцировки клеток и тканей уже позади; наблюдаемые фенотипы соответствуют нокауту определённого гена. Контрольные[англ.] нуклеотиды, не нацеленные на какие-либо последовательности, как правило, не вызывают изменений в фенотипе зародыша, подтверждая, что морфолиновые олигонуклеотиды действуют специфично к последовательностям и, как правило, не имеют не-антисмысловых эффектов. Дозу, необходимую для нокдауна гена, можно сократить, одновременно вводя несколько морфолиновых олигонуклеотидов, нацеленных на одну и ту же мРНК; этот приём позволяет сократить или вовсе исключить зависимые от дозы взаимодействия олигонуклеотидов с РНК, не являющимися непосредственными мишенями[32].

В экспериментах по «спасению» мРНК у зародышей часто удавалось вернуть фенотип

5'-нетранслируемую область, а потому не имеет последовательности-мишени для морфолинового олигонуклеотида, но её кодирующая область сохранена и с неё синтезируется интересующий белок. Трансляция с мРНК-«спасателя» восстанавливает образование белка, остановленное морфолиновым олигонуклеотидом. Спасательная мРНК не вызывает фенотипических отклонений, так как не действует на экспрессию генов, не являющихся мишенью введенного олигонуклеотида, поэтому возврат к фенотипу дикого типа служит ещё одним доказательством специфичности морфолиновых олигонуклеотидов по отношению к последовательности[31]
.

Из-за совершенно неестественного химического строения морфолиновые олигонуклеотиды не распознаются клеточными белками. Нуклеазы их не разрушают[33], поэтому они не разрушаются ни в клетках, ни в плазме крови[34]. Морфолиновые олигонуклеотиды не активируют Toll-подобные рецепторы, а потому не запускают врождённый иммунный ответ, выражающийся, в частности, в образовании интерферона или в NF-κB-опосредованном воспалении[35].

До 18 % морфолиновых олигонуклеотидов вызывают не связанные с исходными мишенями фенотипы, в частности, смерть клеток центральной нервной системы и сомитов у зародышей данио-рерио[36]. Было показано, что большая часть этих эффектов связана с активацией p53-опосредованного апоптоза; их можно подавить, одновременно вводя экспериментальный морфолиновый олигонуклеотид и его анти-p53-аналог. Более того, вызванную морфолиновым олигонуклеотидом активацию p53-опосредованного апоптоза удалось повторить с использованием других антисмысловых структур, что говорит в пользу того, что p53-опосредованный апоптоз может быть вызван утратой белка-мишени и не зависит от типа олигонуклеотида, используемого для нокдауна[37].

Морфолиновые олигонуклеотиды следует использовать с осторожностью из-за их потенциальных эффектов вне белка-мишени. Для проверки того, является ли наблюдаемый фенотип морфанта результатом нокдауна задуманного гена или же он вызван взаимодействием с РНК, не являющейся непосредственной мишенью введенного олигонуклеотида, можно провести второй эксперимент. Этот эксперимент заключается в повторении фенотипа (фенокопировании) морфанта с использованием другого морфолинового олигонуклеотида, нацеленного на ту же мишень, но не перекрывающегося с первым олигонуклеотидом[31].

Доставка

Для того, чтобы морфолиновый олигонуклеотид мог подействовать, он должен попасть в цитозоль клетки и преодолеть

ядром, как было показано в экспериментах, при которых введение морфолинового нуклеотида в цитозоль клетки изменяло сплайсинг в ядре[6]
. Для доставки морфолинового олигонуклеотида в зародыши, клетки культуры или клетки взрослых животных используются различные методы.

Для доставки в зародыши, как правило, используют микроинъекции[англ.], причём введение олигонуклеотидов обычно осуществляют на стадии одной или нескольких клеток[38]. Альтернативный метод для доставки морфолиновых олигонуклеотидов в эмбрионы — электропорация, которая позволяет доставить их в ткани на более поздних стадиях развития зародыша[39].

Наиболее распространённые методы для доставки морфолиновых олигонуклеотидов в клетки культуры — использование эндопортерного пептида (англ. Endo-Porter peptide), который вызывает высвобождение морфолиновых олигонуклеотидов из эндосом[17]; система специальной доставки (англ. Special Delivery system), использующая гетеродуплекс ДНК с морфолиновым олигонуклеотидом и этоксилированный[англ.] полиэтиленимин[англ.] в качестве реагента доставки (больше коммерчески недоступна)[16]; электропорация[40]; метод соскоба-загрузки (англ. scrape loading)[41]. В 2015 году была описана транс-активирующая амфипатическая система доставки, основанная на ДНК, которая предназначена для удобной доставки незаряженных нуклеиновых кислот, имеющих поли(А)-хвост, таких как пептидо-нуклеиновые кислоты и морфолиновые олигонуклеотиды[42].

Доставка морфолиновых олигонуклеотидов в ткани взрослых животных затруднительна, хотя разработано несколько систем, позволяющих доставить в ткани немодифицированные морфолиновые олигонуклеотиды (в частности, в от природы слабые мышечные клетки при мышечной дистрофии Дюшена

пептидов[45][46], в условиях in vivo удалось добиться эффективной доставки морфолиновых олигонуклеотидов при дозах пептидов ниже токсичных[9][47]. Октагуанидиновый дендример, прикреплённый к концу морфолинового олигонуклеотида (т. н. Vivo-Morpholino), обеспечивает его доставку из крови в цитозоль при систематическом введении во взрослого животного[48][49]
.

Медицинское значение

Морфолиновые олигонуклеотиды, способные к эффективной доставке (такие как связанные с пептидами морфолиновые олигонуклеотиды и Vivo-Morpholino), могут быть перспективными средствами для лечения вирусных и генетических заболеваний[50]. Например,

клинические испытания морфолиновые олигонуклеотиды, которые могут использоваться для лечении миодистрофии Дюшенна у человека[51]
.

Примечания

  1. ↑ Аппель и др., 2013, с. 206.
  2. ISSN 2218-2268. Архивировано
    5 марта 2016 года.
  3. ↑ Н. М. Белоногова. «Прямая» и «обратная» генетика. Генетика количественных признаков // Вавиловский журнал генетики и селекции. — 2014. — Т. 18, № 1. — С. 147—157.
  4. ↑ Т. В. Абрамова, В. Н. Сильников. Синтез и свойства модифицированных по углеводофосфатному остову аналогов олигонуклеотидов и миметиков нуклеиновых кислот // Усп. хим.. — 2011. — Т. 80, № 5. — С. 452—476.
  5. ↑ 1 2 Summerton J. Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H-independent structural type. (англ.) // Biochimica et biophysica acta. — 1999. — Vol. 1489, no. 1. — P. 141—158. — PMID 10807004. [исправить]
  6. ↑ 1 2 3 Draper B. W., Morcos P. A., Kimmel C. B. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. (англ.) // Genesis (New York, N.Y. : 2000). — 2001. — Vol. 30, no. 3. — P. 154—156. — PMID 11477696. [исправить]
  7. doi:10.1006/dbio.2001.0565. — PMID 11884031. [исправить
    ]
  8. ↑ Geller B. L. Antibacterial antisense. (англ.) // Current opinion in molecular therapeutics. — 2005. — Vol. 7, no. 2. — P. 109—113. — PMID 15844617. [исправить]
  9. ↑
    doi:10.1128/AAC.00069-07. — PMID 17485503. [исправить
    ]
  10. doi:10.1016/j.nmd.2006.05.017. — PMID 16919955. [исправить
    ]
  11. ↑ 1 2 Summerton J., Weller D. Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties. (англ.) // Antisense & nucleic acid drug development. — 1997. — Vol. 7, no. 3. — P. 187—195. — PMID 9212909. [исправить]
  12. doi:10.1038/79951. — PMID 11017081. [исправить
    ]
  13. doi:10.1006/dbio.2000.9720. — PMID 10885751. [исправить
    ]
  14. ↑ Howard E. W., Newman L. A., Oleksyn D. W., Angerer R. C., Angerer L. M. SpKrl: a direct target of beta-catenin regulation required for endoderm differentiation in sea urchin embryos. (англ.) // Development (Cambridge, England). — 2001. — Vol. 128, no. 3. — P. 365—375. — PMID 11152635. [исправить]
  15. ↑ Kos R., Reedy M. V., Johnson R. L., Erickson C. A. The winged-helix transcription factor FoxD3 is important for establishing the neural crest lineage and repressing melanogenesis in avian embryos. (англ.) // Development (Cambridge, England). — 2001. — Vol. 128, no. 8. — P. 1467—1479. — PMID 11262245. [исправить]
  16. ↑ 1 2 Morcos P. A. Achieving efficient delivery of morpholino oligos in cultured cells. (англ.) // Genesis (New York, N.Y. : 2000). — 2001. — Vol. 30, no. 3. — P. 94—102. — PMID 11477682. [исправить]
  17. ↑
    doi:10.1196/annals.1359.012. — PMID 16394126. [исправить
    ]
  18. ↑ Stancheva I., Collins A. L., Van den Veyver I. B., Zoghbi H., Meehan R. R. A mutant form of MeCP2 protein associated with human Rett syndrome cannot be displaced from methylated DNA by notch in Xenopus embryos. (англ.) // Molecular cell. — 2003. — Vol. 12, no. 2. — P. 425—435. — PMID 14536082. [исправить]
  19. doi:10.1093/hmg/ddh272. — PMID 15333583. [исправить
    ]
  20. doi:10.1002/humu.20303. — PMID 16550551. [исправить
    ]
  21. doi:10.1016/j.bbrc.2007.04.172. — PMID 17493584. [исправить
    ]
  22. doi:10.1016/j.cell.2007.09.043. — PMID 18022366. [исправить
    ]
  23. doi:10.1093/nar/gkh968. — PMID 15585662. [исправить
    ]
  24. doi:10.1038/ng1953. — PMID 17220889. [исправить
    ]
  25. doi:10.1371/journal.pbio.0050203. — PMID 17676975. [исправить
    ]
  26. doi:10.1242/bio.2012810. — PMID 23213449. [исправить
    ]
  27. doi:10.1038/nature02844. — PMID 15386015. [исправить
    ]
  28. doi:10.1093/nar/gni041. — PMID 15731334. [исправить
    ]
  29. doi:10.1261/rna.7810204. — PMID 15383681. [исправить
    ]
  30. doi:10.1093/nar/gks1044. — PMID 23172291. [исправить
    ]
  31. ↑
    doi:10.1089/zeb.2008.0555. — PMID 19374550. [исправить
    ]
  32. doi:10.1002/dvg.20361. — PMID 18196596. [исправить
    ]
  33. ↑ Hudziak R. M., Barofsky E., Barofsky D. F., Weller D. L., Huang S. B., Weller D. D. Resistance of morpholino phosphorodiamidate oligomers to enzymatic degradation. (англ.) // Antisense & nucleic acid drug development. — 1996. — Vol. 6, no. 4. — P. 267—272. — PMID 9012862. [исправить]
  34. doi:10.1021/bc060138s. — PMID 17226957. [исправить
    ]
  35. ↑ Jon D. Moulton. A Brief Introduction to Morpholino Antisense. — 2011.
  36. ↑ Ekker S. C., Larson J. D. Morphant technology in model developmental systems. (англ.) // Genesis (New York, N.Y. : 2000). — 2001. — Vol. 30, no. 3. — P. 89—93. — PMID 11477681. [исправить]
  37. doi:10.1371/journal.pgen.0030078. — PMID 17530925. [исправить
    ]
  38. doi:10.3791/1115. — PMID 19274045. [исправить
    ]
  39. doi:10.1016/j.ymeth.2005.12.009. — PMID 16837210. [исправить
    ]
  40. ↑ Jubin R. Optimizing electroporation conditions for intracellular delivery of morpholino antisense oligonucleotides directed against the hepatitis C virus internal ribosome entry site. (англ.) // Methods in molecular medicine. — 2005. — Vol. 106. — P. 309—322. — PMID 15375324. [исправить]
  41. ↑ Partridge M., Vincent A., Matthews P., Puma J., Stein D., Summerton J. A simple method for delivering morpholino antisense oligos into the cytoplasm of cells. (англ.) // Antisense & nucleic acid drug development. — 1996. — Vol. 6, no. 3. — P. 169—175. — PMID 8915501. [исправить]
  42. doi:10.1039/C5RA12038A
    .
  43. doi:10.1002/jgm.838. — PMID 16285002. [исправить
    ]
  44. ↑ Kipshidze N. N., Kim H. S., Iversen P., Yazdi H. A., Bhargava B., New G., Mehran R., Tio F., Haudenschild C., Dangas G., Stone G. W., Iyer S., Roubin G. S., Leon M. B., Moses J. W. Intramural coronary delivery of advanced antisense oligonucleotides reduces neointimal formation in the porcine stent restenosis model. (англ.) // Journal of the American College of Cardiology. — 2002. — Vol. 39, no. 10. — P. 1686—1691. — PMID 12020498. [исправить]
  45. doi:10.1016/j.jconrel.2006.09.011. — PMID 17097177. [исправить
    ]
  46. doi:10.1128/JVI.02360-06. — PMID 17344287. [исправить
    ]
  47. doi:10.1021/bc070060v. — PMID 17583927. [исправить
    ]
  48. doi:10.1021/bc8001437. — PMID 18564870. [исправить
    ]
  49. ↑ Morcos P. A., Li Y., Jiang S. Vivo-Morpholinos: a non-peptide transporter delivers Morpholinos into a wide array of mouse tissues. (англ.) // BioTechniques. — 2008. — Vol. 45, no. 6. — P. 613—614. — PMID 19238792. [исправить]
  50. doi:10.3390/molecules14031304. — PMID 19325525. [исправить
    ]
  51. ↑ Efficacy Study of AVI-4658 to Induce Dystrophin Expression in Selected Duchenne Muscular Dystrophy Patients. Дата обращения: 25 октября 2015. Архивировано 8 декабря 2015 года.

Литература

  • Б. Аппель и др. Нуклеиновые кислоты: от А до Я / под ред. С. Мюллер. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2013. — С. 206. — 413 с. — ISBN 978-5-9963-0376-2.
  • Subbotina E., Koganti S. R., Hodgson-Zingman D., Zingman L. V. Morpholino-driven gene editing: A new horizon for disease treatment and prevention. (англ.) // Clinical pharmacology and therapeutics. — 2015. —
    doi:10.1002/cpt.276. — PMID 26474085. [исправить
    ]
  • Bhadra J., Pattanayak S., Sinha S. Synthesis of Morpholino Monomers, Chlorophosphoramidate Monomers, and Solid-Phase Synthesis of Short Morpholino Oligomers. (англ.) // Current protocols in nucleic acid chemistry / edited by Serge L. Beaucage ... [et al.]. — 2015. — Vol. 62. — P. 4—65. —
    doi:10.1002/0471142700.nc0465s62. — PMID 26380905. [исправить
    ]
  • Moulton H. M. In vivo delivery of morpholino oligos by cell-penetrating peptides. (англ.) // Current pharmaceutical design. — 2013. — Vol. 19, no. 16. — P. 2963—2969. — PMID 23140456. [исправить]

Ссылки

Источник — https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=Морфолиновые_олигонуклеотиды&oldid=133376346